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miRNA主要通過與靶mRNA的結(jié)合，或促使mRNA降解，或阻礙其翻譯，從而抑制目的基因的表達(dá)。用生物信息學(xué)方法準(zhǔn)確快速地預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，可以為研究miRNA功能提供線索。
下面總結(jié)一些熒光素酶實(shí)驗(yàn)中常見的問題。
1轉(zhuǎn)染成功如何判斷？
共轉(zhuǎn)染的幾個(gè)質(zhì)粒中，3' UTR質(zhì)粒及Renilla質(zhì)粒可通過zui終的luc讀值判斷是否轉(zhuǎn)染成功，而miRNA質(zhì)粒或mimic的轉(zhuǎn)染情況無法從zui終的luc讀值做出判斷，因而針對(duì)miRNA，轉(zhuǎn)染是否成功可用以下方法進(jìn)行：
i.如轉(zhuǎn)入的miRNA帶熒光標(biāo)記如GFP，則可直接在轉(zhuǎn)染后、細(xì)胞裂解前，顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光；
ii.如轉(zhuǎn)入的miRNA不帶任何熒光標(biāo)記，可考慮進(jìn)行miRNA的qRT-PCR檢測(cè)，通過檢測(cè)結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)組2、4、6是否相對(duì)其對(duì)照組miRNA有顯著過表達(dá)。
iii.設(shè)置一個(gè)熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照組，同批轉(zhuǎn)染一個(gè)組的細(xì)胞，間接反映出同批次實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染情況。
2如何判斷實(shí)驗(yàn)體系無異常，獲得客觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果？ 可以從以下幾個(gè)方面來考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性：
對(duì)照的2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2 luc表達(dá)情況應(yīng)無顯著差異； 轉(zhuǎn)染正常，質(zhì)粒或mimic確保成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞； luc檢測(cè)值在儀器檢測(cè)線性范圍內(nèi)。
3 陰性結(jié)果如何理解？
在確保實(shí)驗(yàn)體系無異常的前提下，如果zui終檢測(cè)到的結(jié)果是陰性結(jié)果，則基本可以判斷目的miRNA不能直接調(diào)控靶基因的表達(dá)，不死心的話就再做一次，如果仍然是陰性結(jié)果，死心吧。
有的同學(xué)說我一次做出陽性結(jié)果一次做出陰性結(jié)果咋辦？那就恭喜你再重復(fù)吧，結(jié)果一直波動(dòng)的話可能是實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或其他原因，
4為何與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)有差異？
實(shí)驗(yàn)中，我們往往會(huì)遇到無法重復(fù)出文獻(xiàn)中結(jié)果的問題，這是肯定的，不同實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)并不能確保與文獻(xiàn)*一致所致。因此，只要我們相信自己就行。
5實(shí)驗(yàn)體系是否可以優(yōu)化？如何優(yōu)化？
該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)在細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化可通過調(diào)整共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的比例或調(diào)整轉(zhuǎn)染體系來進(jìn)行，設(shè)置合理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量梯度，觀察microRNA對(duì)靶基因的抑制是否存在劑量效應(yīng)或是否存在變化趨勢(shì)的一致性，從而使結(jié)論更加可靠。
6使用mimics的一些問題？
有的同學(xué)喜歡使用mimics來做實(shí)驗(yàn)，其實(shí)mimics就是體外合成的成熟體miRNA，同樣可以反轉(zhuǎn)錄，用qRT-PCR來檢測(cè)表達(dá)量，但是大家應(yīng)該很少看到有文章把mimics的過表達(dá)量PCR結(jié)果放出來的吧，那是因?yàn)閙imics的過表達(dá)通常在數(shù)萬到數(shù)十萬倍，miIRNA通常會(huì)靶向結(jié)合許多靶基因，這么強(qiáng)的外源過表達(dá)肯定會(huì)引起嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，給審稿人把柄質(zhì)疑你嗎？對(duì)于這種找抽的行為大家肯定是積極規(guī)避的。質(zhì)粒介導(dǎo)的miRNA過表達(dá)由于是模擬了前體在生物體內(nèi)的剪切，其過表達(dá)通常在數(shù)十倍到數(shù)百倍，可能引起的脫靶效應(yīng)遠(yuǎn)沒有mimics嚴(yán)重。
7是否還有其他方法驗(yàn)證miRNA對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控？
驗(yàn)證miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控，也可直接檢測(cè)miRNA過表達(dá)或下調(diào)表達(dá)后，靶基因在mRNA（qRT-PCR方法）或蛋白水平上的變化（Western Blot方法）。
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